Jay D. Keasling开发基于Cas9工具蛋白质体外进化方法

生物极客2018-08-02 07:45:42

Keasling课题组描述了一种稳健的方法。该方法采用易错PCR和Cas9,介导突变的基因整合到单个或多个基因组位点,效率达到98-99%。为了验证该方法对代谢基因产物的定向进化的适用性,我们在的甲羟戊酸途径中设计了两种必需的酶,其中所选择的变体支持高出11倍的类异戊二烯产生。通过促进同源基因组环境中数百个核苷酸的有效诱变而扩展到现有的CRISPR技术。

作为原理验证,在酵母酿酒酵母中应用该方法以设计编码香叶基香叶基二磷酸合酶和600bp区域的非必需基因的300bp催化结构域。 编码HMG-CoA还原酶的非必需基因。

最后,目前,大多数基于CRISPR / Cas9的定向进化方法依赖于相对较小(80-120bp)DNA片段的整合并且可能需要耗时构建变体文库和/或多样化的基于阵列的寡核苷酸的相对昂贵的DNA合成。使用CasPER,现在可以在整个供体片段长度范围内以非常高的效率证明较大基因组位点的多重基因组工程,从而可以实现任何复杂的多基因性状的成本效益,高通量和稳健的进化研究。 通过同源重组支持异源DNA基因组整合的生物体。



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