生物类似药相似性分析(四):Benepali(SB4)与Enbrel对比分析

生物制药小编Armstrong2018-04-29 00:42:13

 

20161月末,EMA批准了第一个Enbrel类似药,来自三星Bioepis与百健合作开发的Benepali1季度,上市仅1个月的Benepali销售额200万美元。山德士Enbrel类似药GP2015预计2017年一季度递交上市申请。


Enbrel有两种规格25mg50mgBenepali只有50mg规格。价格上以英国为例,Enbrel4*25mg357欧元,4*50mg715欧元,4*50mgBenepali656欧元,折扣为10%左右。

 

相似性总体方案:

依那西普采用CHO细胞系表达,是一种融合蛋白:TNFR2-IgG1-FcTNFR2domain含有4个富半胱氨酸域、2N-位点、13O-糖基化位点;Fc域含有1N-糖基化位点。TNFR2域可以和TNF结合,阻断TNF与细胞表面受体的结合,Fc则起到延长半衰期作用。根据作用机制(MOA)建立CQA评估和检测方法。影响TNFR结合与相关效应的质量属性被认为是CQAFc的效应作用包括ADCCCDC与作用机制无关,相应的质量属性不认为是CQA



三星Bioepis共使用了42中理化-结构分析方法、19分析方法,使用了超过60批欧美市场的Enbrel参照药(欧美的Enbrel高度相似但并非完全一致),分析两者的相似性。



分析结果显示,总体上BenepaliEnbrel在结构、理化性质、生物活性上高度相似,在免疫原性相关的疏水、高聚物、α-1,3-galactose方面,Benepali含量均低于Enbrel


在对比分析中,共检测了61个参数,使用方法为正交方法,CQA进行了着重评估。根据具体参数不同,可能采用one-sided或者two-sided来设定参数范围。One-sided如杂质含量只设定上限、主峰纯度只设定上限等,two-sided如唾液酸组分含量、电荷异构体、TNF亲和力等要设定上下限。

 

一级结构和二硫键:

根据欧美生物类似药指导原则,一级结构必须完全一致。虽然DNA序列可以间接决定蛋白序列,仍须进行进一步的直接分析如肽图等。进行了LC-ESI-MS/MS肽图分析(100%覆盖率)、二硫键分析、N-糖基化/O-糖基化profile分析、N/C端测序,同时评估了脱酰胺、氧化、N/C端异质性。在所有分析,都设定了不同条件:还原/非还原、酶切前/后、去糖基化/非去糖基化、去唾液酸化/非去唾液酸化。结果显示两者具有高度相似性。



BenepaliEnbrel相似,N端具异质性:缺少12个氨基酸。

1-      LPAQVAFTPYAPEPGSTCR

2-      PAQVAFTPYAPEPGSTCR

3-      AQVAFTPYAPEPGSTCR

 

文献报道,N-端异质性不影响生物活性。Bioepis制备了三种样品,生物活性试验证实了该结论。同样C-端异质性也不影响生物活性。

 

依那西普含有13对链内二硫键和3对链间二硫键,所以所有58个半胱氨酸(单链29个)都参与形成了二硫键。



氧化产物进行了比较,主要是Met187Met272,结果显示两者氧化铝相似。脱酰胺涉及7个位点:Asn335,Asn381,Asn404, Ans409, Ans410, Asn441 Asn454,结果显示一致(未列出)。



分子量:

采用LC-ESI-MS测定分子量。首先,去N-糖基化和去唾液酸化,测定保留O-糖基化的分子量。依那西普有13个潜在的O-糖基化位点,但主要的O-糖型含有8-10O-糖基化(10 GalNAcβ(1,3)Gal)。测定含10O-糖基化组分的单链蛋白分子量为54763Da,与理论分子量误差不超过0.01%

 

根据3N-糖基化位点、唾液酸含量最多16mol/molchain,预测单链分子量65kDa左右,总分子量130kDa



高聚物与免疫原性相关,SEC分析显示Benepali高聚物含量低于Enbrel(下图B),高聚物在层析上是一个峰,SEC分析显示为两个峰,HMW1为四聚体,HMW2为二聚体。BenepaliEnbrel高聚物总含量分别为2.3%-3.1%and 2.9%-3.4%。同时两者均含低分子量异构体,含量略有差异,主要是由于与主峰分离度不够。



纯度和产品相关杂质:

产品相关杂质会影响到安全性和有效性,SECCE-SDSICIEFHIC方法用来分析纯度和相关杂质。

HIC分析含3个峰,peak1为片段,peak2为依那西普,peak3为聚集体。对于peak3BenepaliEnbrel的含量分别为5.4-6.9%13.5-13.6%peak3包含聚集体和二硫键错配体,这与SEC结果一致,Enbrel高聚物组分更多。活性方面,BenepaliPeak 3活性为依那西普的32%Enbrelpeak 3的活性为依那西普的16%


CE-SDS纯度相似。



糖基化:

糖基化对活性、免疫原性、清除率影响很大。

HILIC-荧光检测器分析,显示有23N-糖基化异构体峰,Benepali其中21个经过LC-MS/MS鉴定,与Enbrel相应的N-糖基化异构体分子量完全一致。


经过分析,两者的主要糖型均一致:Asn147的主要糖型为G2 and G2S1 Asn179的主要糖型为G2F and G2FS1Asn317的主要糖型为 G0F and G1F。只是含量有一些轻微差异。



三种主要的O-糖基化形式如下图,peak 1β-消除处理、peak 2为单唾液酸、peak 3为双唾液酸(下图A)。唾液酸含量被认为会影响药物半衰期,总唾液酸含量相似(下图B),各个峰的NGNANANA含量相似(下图C)。



高级结构:

通过氢氘交换(HDX)、微量热交换(DSC)、粒度测量(DLS)、荧光光谱、FTIR、圆二色谱(CD)全面分析两者相似性。

氘代动力学图谱重合。同时分析了167个肽段(覆盖率92.5%)的单独氘代动力学图谱,均重合。



BenepaliEnbrel3个热转变温度:Tm1Tm2Tm3,均重合。说明热稳定性质高度相似。



生物活性:

依那西普通过阻断TNF起到减轻炎症反应的作用。三星Bioepis进行了15项生物活性测试,可以分为三类:

  1. TNFR2相关的结合力测试:包括包括人TNF结合、LTα结合及蒸饺TNF结合分析;

  2. Fc相关的结合力测试:包括FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb,FcγRIIIa (V158 allotype), FcγRIIIa(F158 allotype), FcγRIIIb, FcRn, and C1q

  3. 细胞水平测试:包括TNF中和、ADCCCDC和细胞凋亡分析。

 

TNF结合、LTα结合通过FRET检测,结果Benepali的数据与43批美国Enbrel/46批欧洲Enbrel相似(下图AB)。TNF中和通过luciferase报告基因检测,结果Benepali的数据与40批美国Enbrel/40批欧洲Enbrel相似(下图C)。



通过SPR来检测TNF结合、LTα结合,结果发现两者数据相似(下图AB)。通过表达膜TNF的细胞诱导凋亡试验,发现两者数据相似(下图C)。



临床有效性:具有可比性



临床药代动力学:具有可比性


临床安全性:具有可比性。



总结:

这里列举了一部分BenepaliEnbrel在理化性质、体外活性、非临床药理毒理学研究、临床安全性有效性的对比研究,证实了两者高度相似,使得EMA相信Benepali的风险-收益比数据是积极的,批准其上市。


本文为生物类似药相似性分析系列第4篇文章,前3期可参见:

  1. 生物类似药相似性分析:ZarxioRemsima为例(一

  2. 生物类似药相似性分析:ZarxioRemsima为例(二

  3. 生物类似药相似性分析(三):以GP2013(利妥昔单抗)为例


参考文献:

  1. Evaluationof the structural, physicochemical, and biological characteristics of SB4, abiosimilar of etanercept, 2016;

  2. EtanerceptBiosimilar (Benepali®), NTAG, 2016

  3. Biosimilarsin rheumatology: understanding the rigor of their development, 2016



作者:Armstrong

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